‧Q & A

Q:怎樣對合成DNA製品進行定量?

A:

DNA的量與260 nm處的吸光值(OD值)成正比,因此使用紫外分光光度計定量是最科學的。1個OD值的合成DNA的重量約為33 mg。


 Q:怎樣理解測定的OD值?

 A:

進行OD值測定時,分光光度計上顯示的數值為每毫升溶液中的OD值。當測定200 ml溶液中的OD值為1.5時,溶液整體的OD量應該為多少? 此時的OD值 = 1.5 OD/ml × 0.2 ml = 0.3 OD


 Q:合成DNA溶液在室溫下放置了數天,還可以使用嗎?

 A: 

溶液中的Oligo DNA常溫下數天(3-4天)應該沒問題,但最好不要放置一個星期以上。其壽命受溶液中的菌體、核酸水解(nuclease)等的影響。


 Q:製品溶解後發現有少許沉澱,會影響實驗結果嗎?
 A:

所有的製品純化後都要進行脫鹽,脫鹽是使用G-25進行的,偶而會有微量的粉末溢出而進入製品。粉末不影響任何反應結果,請稍許離心後取上清使用。


 Q:為什麼PAGE級和高純度級製品的提供量比其他公司少?

 A: 

無論是PAGE純化,還是HPLC純化,增大每次的純化量會大大降低製品的純度。所以,為了保證製品質量,我們一般把每次的純化量控制在2 OD左右。大OD量的提供對提高純度是不現實,不科學的做法。 一般,2 OD的20mer的DNA製品 (約10 nmol),可以進行400-500 次的PCR反應 (total 50 l , primer conc = 10uM),以及3000次的定序反應(primer conc = 3.2uM)。因此,2 OD 的DNA量可以足夠進行一般的實驗工作。


 Q:我公司的DNA製品包裝中為什麼不提供電泳照片?

 A:

進行過Oligo DNA PAGE電泳的人員都知道,同一OD量的不同序列的DNA製品電泳時的泳帶(band)亮度(清晰度)是不一樣的。原因在於EtBr等染色劑的染色是滲透至DNA的雙鏈之間的,而合成的Oligo DNA是單鏈,Oligo DNA自身形成的立體結構越複雜,EtBr的染色就越容易,DNA帶也就越亮。相反,有一些Oligo DNA由於不形成立體結構,根本就不為EtBr所染色。因此,我們認為有些公司對所有產品都提供差不多同一亮度的製品的電泳照片是非常不現實的做法。


 Q:使用3%的Agarose凝膠電泳合成Oligo DNA製品,發現有很多條泳帶(band),為什麼?

 A:

Oligo DNA的電泳一定要使用變性PAGE電泳。Oligo DNA是單鏈DNA,容易形成複雜的立體結構,因此進行Agarose電泳時,容易出現多條泳帶(更無法用Agarose電泳進行定量了)。


 Q:進行PAGE電泳時,長度完全一樣的Oligo DNA為什麼泳帶不在同一位置?

 A:

我們分析後認為主要有以下原因:

1. A、G、C、T的組份不同,電泳速度不同;
2. DNA的立體結構不同,電泳速度不同。

這種情況在Oligo DNA越短時越容易發生,長鏈Oligo DNA之間差別較小。


 Q:PCR產物經克隆後定序發現,引物處的鹼基有錯誤,為什麼?

 A:

大部分廠家的說明是:

  1. PCR過程的錯配
  2. 克隆過程的突變。

我們不能否認這種可能性,但這種可能性實在太小,幾乎不可能。 對這種情況,我們經過了認真的分析,總結出了以下一些原因,供參考。

  1. 合成機管路的瞬時阻堵,造成化學反應的瞬間中斷,其結果可能會發生單個(或一部分)鹼基的缺失。
  2. 控制程式失靈,控制錯誤合成。
  3. 合成過程中,鹼基附加至DNA片段之前,鹼基和鹼基之間發生了偶聯,然後再附加到了DNA片段上,造成多鹼基現象。
  4. 合成時鹼基G可能會轉化成烯醇異構體,此時進行PCR反應時G會轉變成A。
  5. 合成過程中的脫嘌呤作用,對脫嘌呤後的鹼基DNA聚合不能識別,此時可能觀察到A或G的缺失。嘌呤含量越高,就越容易發生這種情況。
  6. 不完全的脫保護結果。通常C脫得快,G脫得慢。不完全脫保護會發生鹼基缺失。
  7. 合成過程中的Capping(蓋帽)反應不完全,使短片段DNA繼續參與合成,造成鹼基缺失。

應該說,上述這些情況發生的可能性都極低。然而,合成的DNA鏈越長,發生這種情況的機率也就越大。


 Q:PCR產物經克隆後定序發現,引物處的鹼基有錯誤,怎麼辦?

 A:

  1. 因為引物純度不可能是100%,因此,挑選克隆時,有可能挑選了雜質引物擴增出的PCR產物的克隆。此時,請重新挑選一個克隆定序,也許結果會變好。
  2. 如果挑選2 ~ 3個克隆定序情況還沒改觀,我們會免費重新合成引物。

進行蛋白表達實驗數個月不成功,後經定序發現引物處有錯誤, 怎麼辦?

  1. 表達實驗之前一定要對DNA序列進行驗證,這是實驗的常識。
  2. 我們可以免費重新合成引物。
  3. 如進行索賠時,按國際行業慣例,索賠範圍限於製品價格範圍之內。

 Q:Oligo DNA最長可以合成多少個鹼基?

 A:

以每步反應效率為99%進行計算,粗略計算合成到100個鹼基時,目的DNA片段的比例便為0 (精確數為37.0%)。但有些廠家曾報導合成了150mer的Oligo DNA片段。TaKaRa公司也曾合成過120mer左右的Oligo DNA製品。但根據我們的經驗,要想保證合成DNA的鹼基100%正確,Oligo DNA的長度最好不要超過70mer,80mer以上要想保證一個鹼基不錯就非常危險了,須十分注意。


 Q:平端的PCR產物難以克隆,為什麼?

 A:

由於一般的PCR用引物的5'末端都沒有P,因此,擴增後的PCR產物的5'末端也沒有P。當克隆於去磷酸化的末端平滑載體時,無法克隆進去;而當克隆於非去磷酸化的末端平滑載體時,背景會極高。此時請對PCR產物的5'端進行磷酸 (P) 化處理。


 Q:合成的引物進行PCR反應時無目的帶,怎麼辦?

 A:

PCR反應失敗的原因很多,可以從以下幾個方面考慮。

  1. 引物和模板是否配對,同源性有多大?
  2. 引物本身是否有立體結構,或者二條引物之間是否形成高次結構?
  3. PCR反應用試劑是否能正常工作?
  4. PCR儀是否工作正常?
  5. PCR反應條件是否合適?

如果一切正常,還無法解決問題時,我們可以免費重新合成引物。
如果重新合成的引物也無法解決問題時,請把引物和模板寄送給我們公司,我們可以幫助摸索PCR反應條件。


 Q:若要在合成的引物添加螢光, 怎麼辦?

 A:

目前我們沒有提供 這項服務,只有一般的引子合成。