‧定序申請表(檔案下載)

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檔案 描述
down Chromas lite version 2.33 for Windows 用來觀看定序結果的軟體 [more]
down Finch TV 1.4 for Win, Mac, Linux, Solaris 用來觀看定序結果的軟體 [more]
down CLC Sequence viewer 6.6.2 for Win,Mac,Linux用來觀看定序結果的軟體 [more]
 
  ‧Q & A

Q:以Big Dye為DNA定序反應對那些DNA序列無法解決?

A:

poly A、poly T、poly C、poly G。
poly A及poly T base>10 在 PCR產物做DNA序無法讀過
poly A及poly T base<25 可以接在plasmid就可以讀過
以上狀況對後端定序結果的影響,還須取決於DNA的純度(雜質殘留)
GT、GA、AT、CT等repeat sequence
GC rich、 GT rich 的序列要另做特殊處理與一般反應條件不同,請於訂單上註明。


 Q:利用 miniprep 抽 plasmid 做 DNA 定序要注意那些事項?

 A:

殘留alcohol、salt、EDTA、detergent、organic chemicals會干擾Big Dye反應。
用傳統方法抽取plasmid或未經RNAsae處理的plasmid,請於訂單上註明。
DNA只能溶於純水中,不能溶於含EDTA的buffer (如TE buffer)。


 Q:利用 PCR product 做 DNA 定序要注意那些事項?

 A: 

PCR product一定要是single band,不可以smear。
PCR product定序前須經過純化步驟,去除primer和dNTP。
只能加一個primer。
利用gel elute PCR product時,避免用短波UV照射。


 Q:定序的 DNA 量需要多少?
 A:

依DNA的長度大小而定, 建議一次定序反應所需要的量如下:

PCR product 100-200 bp 
200-500 bp 
500-1000 bp
1000-2000 bp 
>2000 bp
1-3 ng
3-10 ng
5-20 ng
10-40 ng
40-100 ng

進行定序反應前以跑電泳的方式確認

Plasmid: <15 kb 300-400 ng

Phage依抽取方式與長度大小而定,約500-1000 ng。進行定序反應前以測定吸光值的方式確認


 Q:定序用Primer 設計要注意什麼?

 A: 

18 bp < Primer < 25 bp
Tm 值 > 45℃;一般定序反應 annealing 在 50℃。
G-C content介於40-70%。
避免自黏或形成二級構造。
避免重複相同的nucleotide,特別是G應避免連續3個以上。


 Q:如何計算 primer 濃度?

 A:

 Conc. (pmol/μL or μM) = (A260 x100) / (1.54x nA+0.75x nC+1.17x nG+0.92x nT)。


 Q:如何從個人電腦看Sequencing data (圖形檔)?

 A:

早期電腦可下載Chromas (Windows)或是Edit View (Mac)軟體。另可至 Geospiza 網站下載最新免費軟體 FinchTV (for Mac OS X, Windows, Linux, Solaris)。


 Q:本實驗室採用的定序儀、試劑、反應條件?

 A:

Cycle Sequencing Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer BigDyeR Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA) GeneAmp PCR System 9700 Repeat the following for 30 cycles:
‧ Rapid thermal ramp to 96℃
‧ 96℃ for 10 sec
‧ Rapid thermal ramp to 50℃
‧ 50℃ for 5 sec
‧ Rapid thermal ramp to 60℃
‧ 60℃or 4 min


 Q:是否可利用帶有螢光的 PCR product 或帶有螢光的 primer做 DNA 定序?

 A:

有螢光的 PCR product可當作定序反應的模板,但帶有螢光的 primer不能作為定序用。


 Q:目前本實驗室可提供的培養條件?

 A:

一般使用的培養條件為:2× LB Broth (3~6ml) 37 °C,6-12 hrs。另外常用的Antibiotics包括Ampicillin、Kanamycin、Chloramphenicol、Tetracycline、Spectinomycine以及Zeocin等,如果您的菌並不適用以上的條件,請特別註明。若您的菌使用的是比較特殊的Antibiotics(非上述所列),請隨樣品提供給我們,方能代為培養。


 Q:PCR product利用切膠回收的方式純化要注意那些事項?

 A:

若非Single band可自行切下欲定序的band即可送件回,注意請盡量切除不含DNA的膠體,如膠體是2% agarose以上須另做特殊處理與一般條件不同,請於訂單上註明。若希望由本實驗室幫您處理切膠步驟,請附電泳圖,因切膠純化的回收率較低,請送加倍的PCR product。因切膠回收純化後必有agarose殘留影響定序反應,故結果會比一般純化方式差,即可判讀長度較短。


 Q:如何選擇Universal Primer?

 A:

本實驗室目前提供常用的定序引子另有列表,如無法確認並選擇,請在訂單上詳填所使用vector的全名與廠牌,並註明欲定序forward端或(和) reverse端,由本實驗室幫您確認並選擇。若有未列於表中之 Universal primer 請來電詢問。