定序常見問題 Q & A
Q : 以Big Dye為DNA定序反應對那些DNA序列無法解決?

A:

poly A、poly T、poly C、poly G。

poly A及poly T base>10 在 PCR產物做DNA序無法讀過

poly A及poly T base<25 可以接在plasmid就可以讀過 

以上狀況對後端定序結果的影響,還須取決於DNA的純度(雜質殘留)

GT、GA、AT、CT等repeat sequence

GC rich、 GT rich 的序列要另做特殊處理與一般反應條件不同,請於訂單上註明。

Q : 利用 miniprep 抽 plasmid 做 DNA 定序要注意那些事項?

A:

殘留alcohol、salt、EDTA、detergent、organic chemicals會干擾Big Dye反應。

用傳統方法抽取plasmid或未經RNAsae處理的plasmid,請於訂單上註明。

DNA只能溶於純水中,不能溶於含EDTA的buffer (如TE buffer)。

Q : 利用 PCR product 做 DNA 定序要注意那些事項?

A:

PCR product一定要是single band,不可以smear。

PCR product定序前須經過純化步驟,去除primer和dNTP。

只能加一個primer。

利用gel elute PCR product時,避免用短波UV照射。

Q : 定序的 DNA 量需要多少?

A:

依DNA的長度大小而定, 建議一次定序反應所需要的量如下:

PCR product:

100-200 bp

200-500 bp

500-1000 bp

1000-2000 bp

2000 bp

1-3 ng

3-10 ng

5-20 ng

10-40 ng

40-100 ng

進行定序反應前以跑電泳的方式確認

Plasmid: <15 kb 300-400 ng

Phage依抽取方式與長度大小而定,約500-1000 ng。進行定序反應前以測定吸光值的方式確認

Q : 定序用Primer 設計要注意什麼?

A:

18 bp < Primer < 25 bp

Tm 值 > 45℃;一般定序反應 annealing 在 50℃。

G-C content介於40-70%。

避免自黏或形成二級構造。

避免重複相同的nucleotide,特別是G應避免連續3個以上。

Q : 如何計算 primer 濃度?

A:

Conc. (pmol/μL or μM) = (A260 x100) / (1.54x nA+0.75x nC+1.17x nG+0.92x nT)。

Q : 如何從個人電腦看Sequencing data (圖形檔)?

A:

早期電腦可下載Chromas (Windows)或是Edit View (Mac)軟體。另可至 Geospiza 網站下載最新免費軟體 FinchTV (for Mac OS X, Windows, Linux, Solaris)。

Q : 本實驗室採用的定序儀、試劑、反應條件?

A:

Cycle Sequencing Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer BigDyeR Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA) GeneAmp PCR System 9700 Repeat the following for 30 cycles:

  • Rapid thermal ramp to 96℃
  • 96℃ for 10 sec
  • Rapid thermal ramp to 50℃
  • 50℃ for 5 sec
  • Rapid thermal ramp to 60℃
  • 60℃or 4 min
Q : 是否可利用帶有螢光的 PCR product 或帶有螢光的 primer做 DNA 定序?

A:

有螢光的 PCR product可當作定序反應的模板,但帶有螢光的 primer不能作為定序用。

Q : 目前本實驗室可提供的培養條件?

A:

一般使用的培養條件為:2× LB Broth (3~6ml) 37 °C,6-12 hrs。另外常用的Antibiotics包括Ampicillin、Kanamycin、Chloramphenicol、Tetracycline、Spectinomycine以及Zeocin等,如果您的菌並不適用以上的條件,請特別註明。若您的菌使用的是比較特殊的Antibiotics(非上述所列),請隨樣品提供給我們,方能代為培養。

Q : PCR product利用切膠回收的方式純化要注意那些事項?

A:

若非Single band可自行切下欲定序的band即可送件回,注意請盡量切除不含DNA的膠體,如膠體是2% agarose以上須另做特殊處理與一般條件不同,請於訂單上註明。若希望由本實驗室幫您處理切膠步驟,請附電泳圖,因切膠純化的回收率較低,請送加倍的PCR product。因切膠回收純化後必有agarose殘留影響定序反應,故結果會比一般純化方式差,即可判讀長度較短。

Q : 如何選擇Universal Primer?

A:

本實驗室目前提供常用的定序引子另有列表,如無法確認並選擇,請在訂單上詳填所使用vector的全名與廠牌,並註明欲定序forward端或(和) reverse端,由本實驗室幫您確認並選擇。若有未列於表中之 Universal primer 請來電詢問。

引子合成常見問題 Q & A
Q : 怎樣對合成DNA製品進行定量?

A:

DNA的量與260 nm處的吸光值(OD值)成正比,因此使用紫外分光光度計定量是最科學的。1個OD值的合成DNA的重量約為33 mg。

Q : 怎樣理解測定的OD值?

A:

進行OD值測定時,分光光度計上顯示的數值為每毫升溶液中的OD值。當測定200 ml溶液中的OD值為1.5時,溶液整體的OD量應該為多少? 此時的OD值 = 1.5 OD/ml × 0.2 ml = 0.3 OD

Q : 合成DNA溶液在室溫下放置了數天,還可以使用嗎?

A:

溶液中的Oligo DNA常溫下數天(3-4天)應該沒問題,但最好不要放置一個星期以上。其壽命受溶液中的菌體、核酸水解(nuclease)等的影響。

Q : 製品溶解後發現有少許沉澱,會影響實驗結果嗎?

A:

所有的製品純化後都要進行脫鹽,脫鹽是使用G-25進行的,偶而會有微量的粉末溢出而進入製品。粉末不影響任何反應結果,請稍許離心後取上清使用。

Q : 為什麼PAGE級和高純度級製品的提供量比其他公司少?

A:

無論是PAGE純化,還是HPLC純化,增大每次的純化量會大大降低製品的純度。所以,為了保證製品質量,我們一般把每次的純化量控制在2 OD左右。大OD量的提供對提高純度是不現實,不科學的做法。 一般,2 OD的20mer的DNA製品 (約10 nmol),可以進行400-500 次的PCR反應 (total 50 l , primer conc = 10uM),以及3000次的定序反應(primer conc = 3.2uM)。因此,2 OD 的DNA量可以足夠進行一般的實驗工作。

Q : 我公司的DNA製品包裝中為什麼不提供電泳照片?

A:

進行過Oligo DNA PAGE電泳的人員都知道,同一OD量的不同序列的DNA製品電泳時的泳帶(band)亮度(清晰度)是不一樣的。原因在於EtBr等染色劑的染色是滲透至DNA的雙鏈之間的,而合成的Oligo DNA是單鏈,Oligo DNA自身形成的立體結構越複雜,EtBr的染色就越容易,DNA帶也就越亮。相反,有一些Oligo DNA由於不形成立體結構,根本就不為EtBr所染色。因此,我們認為有些公司對所有產品都提供差不多同一亮度的製品的電泳照片是非常不現實的做法。

Q : 使用3%的Agarose凝膠電泳合成Oligo DNA製品,發現有很多條泳帶(band),為什麼?

A:

Oligo DNA的電泳一定要使用變性PAGE電泳。Oligo DNA是單鏈DNA,容易形成複雜的立體結構,因此進行Agarose電泳時,容易出現多條泳帶(更無法用Agarose電泳進行定量了)。

Q : 進行PAGE電泳時,長度完全一樣的Oligo DNA為什麼泳帶不在同一位置?

A:

我們分析後認為主要有以下原因:

  1. A、G、C、T的組份不同,電泳速度不同;
  2. DNA的立體結構不同,電泳速度不同。

這種情況在Oligo DNA越短時越容易發生,長鏈Oligo DNA之間差別較小。

Q : PCR產物經克隆後定序發現,引物處的鹼基有錯誤,為什麼?

A:

大部分廠家的說明是:

  1. PCR過程的錯配
  2. 克隆過程的突變。

我們不能否認這種可能性,但這種可能性實在太小,幾乎不可能。 對這種情況,我們經過了認真的分析,總結出了以下一些原因,供參考。

  1. 合成機管路的瞬時阻堵,造成化學反應的瞬間中斷,其結果可能會發生單個(或一部分)鹼基的缺失。
  2. 控制程式失靈,控制錯誤合成。
  3. 合成過程中,鹼基附加至DNA片段之前,鹼基和鹼基之間發生了偶聯,然後再附加到了DNA片段上,造成多鹼基現象。
  4. 合成時鹼基G可能會轉化成烯醇異構體,此時進行PCR反應時G會轉變成A。
  5. 合成過程中的脫嘌呤作用,對脫嘌呤後的鹼基DNA聚合不能識別,此時可能觀察到A或G的缺失。嘌呤含量越高,就越容易發生這種情況。
  6. 不完全的脫保護結果。通常C脫得快,G脫得慢。不完全脫保護會發生鹼基缺失。
  7. 合成過程中的Capping(蓋帽)反應不完全,使短片段DNA繼續參與合成,造成鹼基缺失。

應該說,上述這些情況發生的可能性都極低。然而,合成的DNA鏈越長,發生這種情況的機率也就越大。

Q : PCR產物經克隆後定序發現,引物處的鹼基有錯誤,怎麼辦?

A:

  1. 因為引物純度不可能是100%,因此,挑選克隆時,有可能挑選了雜質引物擴增出的PCR產物的克隆。此時,請重新挑選一個克隆定序,也許結果會變好。
  2. 如果挑選2 ~ 3個克隆定序情況還沒改觀,我們會免費重新合成引物。
  3. PCR反應用試劑是否能正常工作?
  4. PCR儀是否工作正常?
  5. PCR反應條件是否合適?

進行蛋白表達實驗數個月不成功,後經定序發現引物處有錯誤, 怎麼辦?

  1. 表達實驗之前一定要對DNA序列進行驗證,這是實驗的常識。
  2. 我們可以免費重新合成引物。
  3. 如進行索賠時,按國際行業慣例,索賠範圍限於製品價格範圍之內。
Q : Oligo DNA最長可以合成多少個鹼基?

A:

由於一般的PCR用引物的5'末端都沒有P,因此,擴增後的PCR產物的5'末端也沒有P。當克隆於去磷酸化的末端平滑載體時,無法克隆進去;而當克隆於非去磷酸化的末端平滑載體時,背景會極高。此時請對PCR產物的5'端進行磷酸 (P) 化處理。

Q : 平端的PCR產物難以克隆,為什麼?

A:

由於一般的PCR用引物的5'末端都沒有P,因此,擴增後的PCR產物的5'末端也沒有P。當克隆於去磷酸化的末端平滑載體時,無法克隆進去;而當克隆於非去磷酸化的末端平滑載體時,背景會極高。此時請對PCR產物的5'端進行磷酸 (P) 化處理。

Q : 合成的引物進行PCR反應時無目的帶,怎麼辦?

A:

PCR反應失敗的原因很多,可以從以下幾個方面考慮。

  1. 引物和模板是否配對,同源性有多大?
  2. 引物本身是否有立體結構,或者二條引物之間是否形成高次結構?
  3. PCR反應用試劑是否能正常工作?
  4. PCR儀是否工作正常?
  5. PCR反應條件是否合適?

如果一切正常,還無法解決問題時,我們可以免費重新合成引物。

如果重新合成的引物也無法解決問題時,請把引物和模板寄送給我們公司,我們可以幫助摸索PCR反應條件。

Q : 若要在合成的引物添加螢光, 怎麼辦?

A:

目前我們沒有提供這項服務,只有一般的引子合成。