辛辛苦苦準備定序樣本，拿到數據後卻發現定序失敗沒有得到序列！？

今天讓我們來看看有可能會遇到哪些狀況，以及有什麼方式能改進呢？

1.      定序沒有訊號 (No signal)：

除了螢光染劑訊號之外，其他區域的訊號強度皆低。此情況首先確認是否使用錯誤的引子 (primer)進行定序；若選用的引子為正確，則需要確認引子的Tm值是否與定序的PCR反應的Tm值相符。

2.      定序序列訊號波峰非專一 (Multiple signal)：

若定序結果出現多種螢光訊號重疊的混合波峰使序列無法判讀，表示樣本DNA可能為多種產物；也可能是定序引子可以黏合到DNA模板中兩個以上的位置；或是定序引子的Tm值太高；以及引子末端發生降解 (degradation)都是可能的原因。這時建議可以經切膠純化將單一DNA產物分離出來，或是設計定序使用的專一性引子來改善。若是引子有降解，則重新稀釋或合成引子即可。

3.      訊號突然終止 (Signal dropout)：

通常是因序列中的二級結構 (如：Hairpin Loop或GC富集區)所導致，定序的PCR反應進行時聚合酶 (DNA Polymerase)無法順利通過此二級結構區域造成定序訊號中止，此情況能經特殊解結構試劑 (如：Betaine或7-deaza-dGTP)處理而解決。

4.      連續單核酸 (poly nucleotide)後方訊號雜亂：

由於定序專用聚合酶本身的特性在讀過含有連續多個單核酸序列後會有滑動現象 (Signal Slipping)造成後方訊號雜亂，解決方式為使用另一股的引子進行反向定序；或是跳過連續單核酸序列的區域重新設計引子進行定序。

源資定序服務於上機之前，每個樣本皆會進行品質把關。

測量DNA濃度是否足夠進行定序反應；

PCR樣本純化後跑電泳確認樣本是否為單一產物，

大幅降低定序結果失敗的可能性。

源資定序，客戶放心！

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