1. 除以菌體送件外，其它樣本請隨件附上DNA電泳圖片，並標示圖片中樣品之用量 (µl)。

2. Primer (T7、T3、SP6、M13F、M13R etc.)，自行設計的請標明名稱、濃度 (10 pmole/µl)，每個反應至少提供5 µl。

3. Plasmid DNA或PCR product 溶於ddH2O中，勿溶於TE Buffer中，以免產生干擾。

4. Plasmid DNA送件，體積需>10 µl，濃度>40 ng/µl。

5. 自行純化的PCR product ，純化後體積需>10 µl，濃度>20 ng/µl。

6. 定序完成後，剩餘之DNA保存以一星期為限，逾期銷毀。

殘留Alcohol、Salt、EDTA、Detergent、Organic chemicals會干擾Big Dye反應。

若是使用傳統方法抽取plasmid或未經RNAsae處理的plasmid，請於訂單上註明。

DNA只能溶於純水中，不能溶於含EDTA的buffer (如TE buffer)。

1. PCR product一定要是single band，不可以smear。

2. PCR product定序前須經過純化步驟，去除primer和dNTP。

3. 只能加一個primer。

4. 利用gel elute PCR product時，避免用短波UV照射。

依DNA的長度大小而定, 建議一次定序反應所需要的量如下：

進行定序反應前，以跑電泳的方式做確認。

進行定序反應前，以測定吸光值的方式做確認。

每個定序反應需要 1 µl 濃度為 3.2 µM 的引子，可以依您定序的反應數量來估算。另外，若考量到會有重做的可能性，建議您再多估一些。

請您協助將引子標示濃度及體積，例如: 10 µM (10 µl)，實驗室即會幫您稀釋至 3.2 µM 執行定序。

1. 18 bp < Primer < 25 bp。

2. Tm值減 5℃約等於引子之 annealing溫度，定序時annealing溫度為50℃，因此設計時建議Tm值介於50-58℃。

3. G-C content介於30-80%。

4. 避免引子之間自黏或引子本身形成二級構造。

5. 避免重複相同的nucleotide，特別是G應避免連續4個以上。

Conc. (pmol/μL or μM) = (A260 x100) / (1.54x nA+0.75x nC+1.17x nG+0.92x nT)。

可以上網去下載一些免費的看圖軟體，例如 Chromas，SnapGene Viewer，FinchTV。
Chromas | Technelysium Pty Ltd
SnapGene Viewer | snapgene-viewer
FinchTV | Digital World Biology

★Machine：Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer

★Reagent：BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA)

★PCR System，
1. 98℃ for 5 mins，1 cycle。
2. 96℃ for 10 seconds，
3. 50℃ for 5 seconds，
4. 60℃ for 4 mins，
Repeat the steps (2. To 4.) for 26~30 cycles。
5. 4℃ for ∞，1 cycle。

有螢光的 PCR product可當作定序反應的模板，但帶有螢光的 primer不能作為定序用。

一般使用的培養條件為：2× LB Broth (3~6 ml) 37 °C，6-12 hrs。

另外，常用的Antibiotics包括Ampicillin、Kanamycin、Chloramphenicol、Tetracycline、Spectinomycine以及Zeocin等，如果您的菌並不適用以上的條件，請特別註明。

若您的菌使用的是比較特殊的Antibiotics(非上述所列)，請隨樣品一起提供給我們，方能代為培養。

★若PCR product非Single band可自行切下欲定序的Band即可送件，但請盡量切除其他不含DNA的膠體，而膠體若是2% agarose以上須另做特殊處理與一般條件不同，請務必於訂單上註明。

★若希望由本實驗室幫您處理切膠步驟，請附電泳圖，但切膠純化的回收率較低，請送加倍的PCR product。

請留意 : 因切膠回收純化後必有agarose殘留，會影響定序反應，所以定序結果會比一般純化方式差，也就是會有可判讀長度較短的情形。

★本實驗室目前提供常用的定序引子列表(詳見一般定序服務的Primer list)，如無法確認與選擇，請在訂單上詳填所使用vector的全名及廠牌，並註明欲定序Forward端或(和) Reverse端，由本實驗室幫您確認並選擇。

★若有未列於表中之 Universal Primer ，請來電至本實驗室洽詢。